改进的QuEChERS

1.2.3前处理

称取样品(肝脏、改进肾脏、改进肌肉)2g(精确至0.01g)于50mL聚丙烯离心管中，改进加入混合同位素内标工作液100μL，改进冉加入2mL水，改进涡旋混合1min。改进加入0.2％盐酸-乙腈溶液10mL，改进200r/min振荡10min，改进加入2g氯化钠，改进再振荡10min，改进5000r/min离心5min。改进将全部上清液转移至15mL聚丙烯离心管并40℃氮吹至约5mL，改进加入100mgPSA、改进80mgC₁₈、改进30mgGCB，改进涡旋混合1min，振荡10min，5000r/min离心10min。取全部上清液至另一个15mL聚丙烯离心管中，40℃氮吹至近干，1mL甲醇定容，15000r/min离心5min，上清液供上机测定。

为减少实验过程中带来的污染及背景干扰，全程尽量避免使用聚四氟乙烯器皿而使用聚丙烯材质器皿。

1.3方法学考察

1.3.1基质效应

本实验采用标准工作溶液的配制：准确移取13种PFCs混合标准工作液、混合同位素内标工作液适量，用甲醇配制浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10ng/mL(同位素内标MPFOA浓度为1.5ng/mL、MPFOS浓度为3.0ng/mL)的系列标准工作溶液。MPFOA是定量9种PFCAs的同位素内标，MPFOS是定量4种PFSAs的同位素内标配制的系列标准工作溶液，按照标准工作溶液的配制：准确移取13种PFCs混合标准工作液、混合同位素内标工作液适量，用甲醇配制浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10ng/mL(同位素内标MPFOA浓度为1.5ng/mL、MPFOS浓度为3.0ng/mL)的系列标准工作溶液。MPFOA是定量9种PFCAs的同位素内标，MPFOS是定量4种PFSAs的同位素内标条件测定，绘制标准曲线。同时，选取9种空白样品基质(猪肉、猪肝、猪肾、牛肉、牛肝、牛肾、羊肉、羊肝、羊肾)不加同位素内标按照称取样品(肝脏、肾脏、肌肉)2g(精确至0.01g)于50mL聚丙烯离心管中，加入混合同位素内标工作液100μL，冉加入2mL水，涡旋混合1min。加入0.2％盐酸-乙腈溶液10mL，200r/min振荡10min，加入2g氯化钠，再振荡10min，5000r/min离心5min。将全部上清液转移至15mL聚丙烯离心管并40℃氮吹至约5mL，加入100mgPSA、80mgC₁₈、30mgGCB，涡旋混合1min，振荡10min，5000r/min离心10min。取全部上清液至另一个15mL聚丙烯离心管中，40℃氮吹至近干，1mL甲醇定容，15000r/min离心5min，上清液供上机测定。

采用空白基质溶液作为溶剂配制相同浓度范围的系列基质标准工作溶液，按照色谱柱：AtlantisT3色谱柱(2.1mmx150mm，3μm)；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：2.5mmol/L乙酸铵-甲醇溶液(A)(2.5mmol/L乙酸铵溶液(B)；梯度洗脱程序：0～3min，90％～40％B；3～12min，40％～10％B；12～14min，10％B；14～14.5min，10％-90％B；14.5～18min，90％B绘制标准曲线。通过比较基质标准曲线与溶剂标准曲线方程斜率的比值来判断基质效应的影响。

1.3.2线性范同、检出限、定量限

0.05、0.1、0.5、l、2、5、10ng/mL系列标准工作溶液按照色谱柱：AtlantisT3色谱柱(2.1mmx150mm，3μm)；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：2.5mmol/L乙酸铵-甲醇溶液(A)(2.5mmol/L乙酸铵溶液(B)；梯度洗脱程序：0～3min，90％～40％B；3～12min，40％～10％B；12～14min，10％B；14～14.5min，10％-90％B；14.5～18min，90％B。电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：3500V；蒸汽温度；290℃；离子传输管温度：270℃；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；二级碰撞气：氩气；碰撞气压力：1.5mTorr条件测定，同位素内标法定量，以各个目标物与对应的同位素内标物的峰断积比值为纵坐标、以各目标物浓度与与对应的同位素内标物的浓度比值为横坐标，求线性方程及相关系数。按照GB/T27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中5.4条款规定，在猪、牛、羊的肝脏、肾脏、肌肉空白样品基质中添加预估最低可接受浓度0.15μg/kg，每个样品平行测定10次，计算方法检出限(LOD)=0+3SD、方法定量限(LOQ)=0+10SD。

1.3.3回收率和精密度

按照GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检验要求》，对于未制定MRL限量的物质，回收率实验应在方法测定低限、常见限量指标、一个合理的添加浓度三个水平进行。本实验采用在猪肝、牛肝、羊肝、猪肾、牛肾、羊。肾、猪肉、牛肉、羊肉9个不同基质空白样品中添加0.2、1和2μg/kg三个浓度，每个浓度6个平行，称取样品(肝脏、肾脏、肌肉)2g(精确至0.01g)于50mL聚丙烯离心管中，加入混合同位素内标工作液100μL，冉加入2mL水，涡旋混合1min。加入0.2％盐酸-乙腈溶液10mL，200r/min振荡10min，加入2g氯化钠，再振荡10min，5000r/min离心5min。将全部上清液转移至15mL聚丙烯离心管并40℃氮吹至约5mL，加入100mgPSA、80mgC18、30mgGCB，涡旋混合1min，振荡10min，5000r/min离心10min。取全部上清液至另一个15mL聚丙烯离心管中，40℃氮吹至近干，1mL甲醇定容，15000r/min离心5min，上清液供上机测定。色谱柱：AtlantisT3色谱柱(2.1mmx150mm，3μm)；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：2.5mmol/L乙酸铵-甲醇溶液(A)(2.5mmol/L乙酸铵溶液(B)；梯度洗脱程序：0～3min，90％～40％B；3～12min，40％～10％B；12～14min，10％B；14～14.5min，10％-90％B；14.5～18min，90％B。电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：3500V；蒸汽温度；290℃C；离子传输管温度：270℃；鞘气流速：30arb；辅助气流速：10arb；二级碰撞气：氩气；碰撞气压力：1.5mTorr；同时做空白实验，均扣除本底值后计算同收率及精密度。

1.4数据处理

采用美国ThermoFisherScientific公司Xcalibur3.0软件、Origin8.0版本进行数据处理。

2.结果与分析

2.1色谱和质谱条件优化

2.1.1色谱条件优化

PFCs具有亲水性和疏水性以及一定的表面活性和极性，相关标准及文献多数采川较低硅羟基活性填料的C18液相色谱柱分离、乙腈-乙酸铵水溶液或甲醇-乙酸铵水溶液流动相梯度洗脱，来实现这类化合物的良好分离。本实验重点考察两种流动相体系乙腈-乙酸铵水溶液、甲醇-乙酸铵水溶液对PFCs及同位素内标的灵敏度差异。通过比较相同浓度标液峰而积(见图1)发现，两种流动相梯度洗脱条件下，15种物质峰形均尖锐对称。与乙腈-乙酸铵水溶液流动相相比，以甲醇-乙酸铵水溶液为流动相时，除PFBA峰面积减少29％之外，其他14种物质的色潜峰峰面积增加了22％～151％。所以，本实验选择峰而积较大、灵敏度较高的甲醇-乙酸铵水溶液作为流动相体系。

13种PFCs及2种同位素内标物是羧酸或磺酸盐，在流动相中加入乙酸铵，能使溶液保持一定的pH及离子强度，可以有效地增强电喷雾离子化响应值，并减少溶剂效应，改善峰形。但也有研究表明，较高浓度的乙酸铵对质谱检测有较强的抑制作用。标准及文献中常见的乙酸铵浓度为1～10mmol/L，本实验以甲醇和水为溶剂，分别配制相同浓度的乙酸铵甲醇溶液及乙酸铵水溶液。通过比较1、2.5、5、10mmol/L四个不同浓度条件下的测定结果(见图2)可以看出，PFOS和PFDoA在1、2.5mmol/L浓度的峰面积较高且几乎相等，其余13种物质均在乙酸铵浓度为2.5mmol/L时，色谱峰面积达到最大值。

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